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合成生物学在中药现代化中的应用
中药是指在中医理论指导下，用于预防和治疗疾病并具有康复与保健作用的植物、动物、矿物及其制品。在中国悠久的历史长河中，中医药为中华民族的生命健康、繁衍生息和文化传承做出了巨大贡献。以《黄帝内经》《伤寒杂病论》《神农本草经》等中医药典籍为支撑，中医药形成了系统的理论基础、防治理念和技术体系，在应对伤寒、瘟病等方面发挥了重要作用。近来，中医药在应对非典、新冠疫情等重大传染性疾病中也发挥了不可或缺的作用。尤其是在新冠疫情期间，中医药的使用率和防治有效率都达到了90%以上。当然，中医药也是随着中华文明的发展历程而在不断完善的。自《黄帝内经》伊始，我们的祖祖辈辈都在不断挖掘、尝试、分析与总结可以治病救人的中药材，从中药材的性能、功效的分析到其分类、炮制和配伍规律的总结，逐渐形成了中药学体系。 不过，随着科学的进步、社会文明的发展和生态环境的变化，我国传统中药在应用、发展与推广过程中面临着以下几个方面的问题：①中药的成分复杂，许多中药中的活性成分组成及其作用机制都未完全明确。②中药的质量标准问题，包括中药的活性成分、致敏性/慢性毒性成分，以及中药材种植与后处理过程中引入的污染物的含量控制问题。中药材的活性成分含量易受环境、种植、采收和加工等因素的影响，其控制缺乏可靠的手段，故中药的治疗效果多受中药材道地性的影响，很难实现标准化。③中药还面临着与现代医药学体系如何对接的问题。中医药的理论体系和治疗方法，如诊断参考“望、闻、问、切”，用药依据“君臣佐使，以君药为主，以臣药为辅，佐药共同煎，使药调和诸药”，都与现代医药学存在差异。④中药很难获得知识产权保护，使得其市场竞争力较弱。以上问题都极大限制了中药的开发、应用和市场推广，特别是海外市场的开发。因此，亟需有新的科学方法和技术来帮助中药实现现代化的飞跃。推进中药现代化研究，是保护、发掘、发展和传承中医药的重要途径。早在1996年，中共中央、国务院就明确提出了“实现中药与中药生产现代化”的目标，中药现代化逐渐上升到国家产业战略高度。中药现代化是指将传统中药与现代科学技术相结合，通过科学研究、技术创新和工业化生产等手段，提高中药的疗效、质量和安全性，推动中医药的传承和发展。 1 合成生物学研究可推动中药现代化发展 21世纪以来，合成生物学引领了生命科学领域的第三次革命，成为国际前沿科学的研究热点。合成生物学融合了生物学、工程学、物理学、化学和计算机科学等学科的相关知识，应用其技术可对生物体进行有目标的设计、改造乃至人工合成全新的生物体。合成生物学研究采用理性设计实现从生物元器件、合成途径到复杂的生物合成网络的搭建，最后到构建具有特定功能的人工生物体系，这种“自下而上”的研究策略推动着实验科学向可定量、可预测、人工设计合成生物体的工程科学跨越。得益于基因组和转录组测序技术及蛋白组和代谢组分析技术通量的不断提高与成本下降，越来越多的药用植物的组学信息得到明确，这为中药活性成分的合成生物学研究提供了有利条件。合成生物学研究可高效利用组学数据，挖掘和表征生物元件，进一步解析与重构中药活性成分的生物合成途径，为创建中药活性成分的从头合成技术和明确这些活性成分的药理药效机制奠定基础。合成生物学研究偏重于改造和优化适用于生物合成的微生物底盘细胞，包括大肠埃希菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等细胞，以实现中药活性成分生物合成途径的异源定向合成，同时结合代谢工程对生物合成途径进行全局性调控和优化，得到能高效合成目标活性成分的细胞工厂，再通过发酵工艺和分离纯化工艺优化，最终实现单一中药活性成分的大规模、高纯度生产。通过合成生物学技术还可建立分子标记和检测方法，对中药活性成分进行快速、准确的鉴定和定量分析。因此，在中药研发过程中，利用合成生物学技术不仅能实现复杂中药活性成分的高纯度、规模化的异源定向合成，从而极大地缓解土地资源等的压力，降低生产成本，还有助于中药活性成分药理机制的研究，制定中药质量控制标准，并在此基础上开发拥有自主知识产权的新药。总之，合成生物学可推动中药的现代化发展，提高中药的质量控制标准，为中医药的传承和发展注入新的活力。 2 合成生物学在中药活性成分制备中的应用 随着科学技术的发展，中药活性成分逐渐得到阐释，并发现了不少具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒和保护血管等作用的化合物。例如，来自淫羊藿的淫羊藿素具有治疗晚期肝癌和改善性功能的功效；三七中的人参皂苷具有活血、抗血栓和抗动脉粥样硬化等作用，可用于治疗心脑血管疾病；黄连所含黄连素具有抗菌、抗炎作用，可用于治疗肠胃感染等疾病。中药活性成分是中药之所以能够治病救人的主要物质基础，对中药活性成分进行研究可为疾病治疗提供新的思路和方法，有助于中医药的传承和发展。 借助高效的合成生物学研究策略和技术，研究人员开展了大量的中药活性成分生物合成相关研究工作，不仅加快了众多中药组学信息的解析，还开发了相关组学数据分析与生物元件挖掘的平台，包括plantiSMASH平台、1KP Project数据库等。目前，国内外都已拥有先进的生物元件库，如美国的标准生物元件登记库（http://partsregistry.org/）和我国的合成生物学元件与数据库（www.biosino.org/npbiosys/），它们覆盖了启动子、转录单元、质粒、转座子等元件信息，尤其是对功能性元件异戊烯基转移酶、甲基转移酶、糖基转移酶、萜烯合酶、氧化酶、还原酶等元件的大量挖掘和功能解析，这为解析更多中药活性成分的生物合成途径奠定了强大基础。此外，研究人员还根据不同类型的中药活性成分开发和改造了大肠埃希菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、蓝细菌（Cyanobacteria）、链霉菌（Streptomyces）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等多种微生物底盘，为中药活性成分的异源生物合成途径提供最优的适配底盘。在这些研究的基础上，越来越多的中药活性成分得以实现了基于合成生物学技术的绿色制备。 2.1 合成生物学在青蒿素合成中的应用 我国早在马王堆三号汉墓中发掘的帛书《五十二病方》中就有青蒿入药的记载，《神农本草经》和《本草纲目》等中药学典籍中也都收录了青蒿。青蒿中青蒿素的发现被誉为是我国传统中医药献给世界的重要礼物，获得2015年度诺贝尔生理学或医学奖的我国科学家屠呦呦正是受到东晋葛洪《肘后备急方》中将青蒿“绞汁”用药经验的启示，从“青蒿一握，以水一升渍，绞取汁，尽服之截疟”中意识到青蒿的活性成分可能忌高温或酶解，故提出改用沸点比乙醇低的乙醚提取，最终分离得到了对鼠疟原虫具有100%抑制率的青蒿素。此后，基于青蒿素的联合疗法在世界上得到广为应用，由此挽救了无数疟疾患者的生命。 青蒿素是一种倍半萜类化合物，其生物合成途径十分复杂。2000年，瑞典和荷兰的研究人员首先解析了紫穗槐二烯的生物合成途径。随后，美国加州大学研究团队发现了自紫穗槐二烯生物合成青蒿酸所需的细胞色素P450酶（CYP71AV1）和还原酶，以及氧化青蒿醇所需的脱氢酶（ADH1）；加拿大和比利时的研究人员分别解析了自青蒿醛生物合成二氢青蒿醛所需的还原酶（Dbr2）和将青蒿醛氧化为青蒿酸所需的脱氢酶（ALDH1）。2013年，美国加州大学研究团队在酿酒酵母中构建了青蒿素前体青蒿酸的合成途径，通过优化上游合成途径、抑制竞争途径、优化发酵工艺等策略，使青蒿酸的产量达到25 g/L（图1）。由于从青蒿酸到青蒿素的生物合成途径尚未得到完全解析，所以目前仍采用化学方法实现自青蒿酸到青蒿素的转化，该化学转化收率为55%。相信继续努力之下，未来必能利用合成生物学技术彻底打通青蒿素的异源生物合成途径，完全实现青蒿素的异源生物合成。
2.2 合成生物学在人参皂苷合成中的应用 人参属于五加科人参属植物，是我国最著名的中药材之一。《神农本草经》记载：“人参，味甘微寒，主补五脏，安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心益智。久服，轻身延年。”现代研究表明，人参皂苷是人参中的主要活性成分，是一类具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用的三萜类化合物。人参皂苷根据其皂苷元结构可以分为达玛烷型（dammarane type，四环三萜类化合物）和齐墩果烷型（oleanane type，五环三萜类化合物）2种类型，其中达玛烷型人参皂苷还可进一步根据其C6位是否含有羟基而分为原人参二醇（protopanaxadiol, PPD）型和原人参三醇（protopanaxatriol, PPT）型2种类型（图2）。迄今已从人参属植物中分离并鉴定出约100多种人参皂苷，它们均为上述不同皂苷元的糖基化修饰衍生物。糖基的结构和结合位点、糖链的组成和长度的差异导致不同人参皂苷的水溶性，稳定性等理化性质不同，最终表现出生物活性和药用价值的不同。人参属植物在我国中药学中具有举足轻重的地位，对人参各活性成分的功效进行深入研究有助于促进人参皂苷在现代医药领域中的应用（表1）。
人参皂苷现主要来源于三七和人参等人参属植物。作为三萜类化合物，人参皂苷的生物合成单元异戊烯单元有异戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate, IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP）2种，其生物合成也有甲基赤藓糖醇4-磷酸（methylerythritol 4-phosphate）和甲羟戊酸（meva lonate, MVA）2条途径。2种异戊烯单元IPP与DMAPP反应形成C10单元GPP，GPP再与IPP或DMAPP反应得到C15单元FPP，FPP二聚化形成角鲨烯，角鲨烯在角鲨烯环氧化酶的作用下转化为2,3-环氧角鲨烯，后者再在不同的环氧角鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclases, OSCs）的催化下形成不同环系的三萜母核骨架，最后经过细胞色素P450酶和糖基转移酶元件的修饰形成各种三萜皂苷衍生物。近年来，通过对人参、三七和西洋参的转录组和功能基因的研究，人参皂苷元和人参皂苷的生物合成途径解析获得了非常大的进展。2006年，日本科学家Tansakul等根据OSCs的保守结构域设计兼并引物，利用聚合酶链式反应从人参毛状根的RNA中获得了在人参皂苷生物合成途径中至关重要的达玛烯二醇合成酶PgDDS的编码基因。2011年韩国科学家Han等通过对人参转录组数据的分析并结合茉莉酸甲酯诱导策略获得了一种细胞色素P450酶CYP716A47，该酶被证实主要负责达玛烯二醇的C12位羟基化而合成PPD；2012年Han等又进一步鉴定了催化PPDC6位羟基化的CYP716A53v2，进而完成了PPT生物合成途径的解析。CYP716A53v2还可催化β-香树脂醇的C28位羟基化而合成齐墩果酸。Yue等于2005年从三七的细胞悬液中纯化得到一种可催化人参皂苷Rd转糖基生成人参皂苷Rb1的糖基转移酶UGRdGT，但未鉴定其编码基因。2014年，笔者课题组鉴定了第一种人参来源的糖基转移酶UGTPg1，并证实其能对达玛烯二醇、PPD和多种PPD型人参皂苷的C20位羟基进行糖基化修饰，特别是催化PPD生成人参属植物中含量稀少的人参皂苷CK。稍后，研究人员又报告了人参来源的2组糖基转移酶（UGT74AE2/UGT94Q2和UGTPg45/UGTPg29）都可在PPD的C3位引入一个糖基并使之延伸。2020年，笔者课题组从人参属植物中分离到140多种糖基转移酶，从而解析了多种人参皂苷的生物合成途径。这些生物合成途径的解析为实现人参皂苷的异源生物合成奠定了坚实的元件基础。 随着多种人参皂苷生物合成途径得到解析，以微生物底盘作为细胞工厂实现人参皂苷的异源生物合成受到越来越多的关注。Han等先将PPD生物合成的关键基因PgDDS和CYP716A47导入到酿酒酵母中，结合酵母自身的MVA途径，构建了第一个可从葡萄糖合成PPD的酵母细胞；随后又在该酿酒酵母中转入CYP716A53v2，从而得到了第一个能够合成PPT的酵母菌株。Dai等将来源于人参的PgDDS、CYP716A47和来源于拟南芥的ATR1基因整合到酿酒酵母染色体中，以强化上游MVA途径和环氧角鲨烯的合成等，使酵母的PPD产量达到每升克级水平。笔者课题组通过系统强化前体MVA途径，并针对合成途径中关键的细胞色素P450酶进行优化，大幅提高了酵母细胞工厂合成PPD的产量，10 L发酵罐的产量达到11.0 g/L。此外，通过继续优化从PPD到PPT的合成途径，后续又实现了PPT的高效合成，产量达到5.0 g/L。2014年，随着稀有人参皂苷CK的生物合成途径被完全解析，笔者课题组首次成功地在酿酒酵母底盘细胞中实现了人参皂苷CK的从头合成（产量约1.4 mg/L）。此后，通过代谢工程手段如前体生物合成途径的强化、元件的筛选与改造，以及二磷酸尿苷葡糖合成的优化等，人参皂苷CK的发酵产量得到进一步提高，最高产量达5.7g/L。随着更多人参皂苷的生物合成途径被解析（图3），笔者课题组陆续构建了系列人参皂苷细胞工厂。目前，对于人参皂苷Rh2、Rg3、Rh1、F1、Rg1、Rg2和Re，以及三七皂苷R2和R1，均已实现了在酿酒酵母中的异源生物合成，为高产、绿色、可持续的人参皂苷产业化生产提供了技术支撑和研究经验。
2.3 合成生物学在淫羊藿素合成中的应用 淫羊藿素是淫羊藿的主要活性成分之一，是一种经异戊烯基化和甲基化修饰的黄酮类化合物。淫羊藿素不仅具有神经保护、心血管保护和抗骨质疏松的作用，还可抑制肝细胞癌的发生与发展，诱导慢性髓系白血病细胞凋亡。在我国，淫羊藿素已获得国家药品监督管理局的附条件批准上市，用于治疗晚期肝细胞癌。 为了缓解淫羊藿的资源短缺和淫羊藿素化学合成难度大、污染多等问题，非常有必要开展淫羊藿素的合成生物学研究。淫羊藿素属于黄酮类化合物，其生物合成前体为山萘酚和柚皮素，这些前体的合成途径很早便得到了解析并相继在多种微生物底盘细胞中实现了异源生物合成。2014年，Wu等在大肠埃希菌中组装并优化了柚皮素的完整生物合成途径，柚皮素的发酵产量达到100.6 mg/L。Trantas等则通过在酿酒酵母中分别组装不同来源的类黄酮合成酶，实现了柚皮素、山奈酚、染料木素和槲皮素等多种黄酮类化合物的从头合成。此后，Lyu等还结合生物合成途径优化等策略提高酿酒酵母发酵生产总黄酮类化合物的产量，其中柚皮素和山奈酚的产量分别达到220和86 mg/L。得益于前体山奈酚的生物合成元件一一得到解析，如淫羊藿来源的肉桂酸-4-羟化酶EsC4H、4-香豆酸辅酶A连接酶Es4CL1和Es4CL2、查尔酮合成酶EsCHS3、黄酮醇合成酶EsFLS、黄酮-3-羟化酶EsF3H、异戊烯基转移酶EsPT2等，笔者课题组借助大豆来源的甲基转移酶GmOMT2搭建了一条完整的淫羊藿素生物合成途径。通过在酿酒酵母中引入来源于拟南芥、大肠埃希菌、约氏黄杆菌、箭叶淫羊藿等物种的11种外源基因，并对5种酵母内源基因进行修饰改造等策略，先在酿酒酵母中实现了淫羊藿素前体8-异戊烯基山奈酚的从头合成，然后又采用两种策略解决催化8-异戊烯基山奈酚合成淫羊藿素的甲基转移酶元件与酵母细胞质pH不适配的问题，分别实现了淫羊藿素的从头合成（图4）：一种策略是通过将关键的甲基转移酶元件定位于具有更高pH的酵母线粒体中，实现酵母从头合成淫羊藿素，摇瓶发酵产量为7.2 mg/L；另一种策略是将甲基转移酶元件构建到大肠埃希菌中，并与产8-异戊烯基山奈酚酵母菌株进行共培养，淫羊藿素的发酵产量提高到19.7 mg/L，这种微生物共培养的设计也为天然产物的异源生物合成提供了新策略。
2.4 合成生物学在其他中药活性成分合成中的应用 对于其他多种中药活性成分，研究人员也进行了深入的合成生物学研究。例如，被誉为“神龙草”的甘草具有清热解毒、止咳祛痰、补脾益气、抗病毒和消炎的功效，而甘草酸是甘草中含量最高的三萜类化合物，也是甘草的主要活性成分。Xu等通过对α-香树脂合成酶和细胞色素P450酶进行改造，并引入哺乳动物来源的糖基转移酶和二磷酸尿苷葡糖脱氢酶，在酿酒酵母中成功实现了甘草酸的从头合成，甘草酸的摇瓶发酵产量为5.98 mg/L。 蛇床子素是蛇床子的重要活性成分，是一种香豆素类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫功能等作用。Wang等通过鉴定并引入香豆素合成酶、异戊烯基转移酶和甲基转移酶基因，首次在酿酒酵母中构建了蛇床子素的生物合成途径，再经解决蛋白表达、辅因子供应等问题和优化发酵工艺等，最终使蛇床子素的发酵产量达到255.1 mg/L。 丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈等功效，其主要活性成分丹参酮为二萜类化合物，对预防和治疗心脑血管系统疾病有显著效果。研究人员通过代谢组学和转录组学分析获得了可能与丹参酮生物合成相关的候选基因，并成功克隆其中2种基因SmCPS和SmKSL，在酿酒酵母中构建并优化了能高效合成次丹参酮二烯的功能模块，使次丹参酮二烯的发酵产量达到488 mg/L。次丹参酮二烯是丹参酮生物合成的关键前体。此后，Ma等又发现了一个与丹参酮生物合成相关的大型基因簇，这将加速丹参酮生物合成途径的解析进程。 3 结语 从青蒿中寻找到了抗疟药青蒿素，从淫羊藿中寻找到了晚期肝癌治疗药淫羊藿素，这些事实说明，中医药不愧是中华民族的瑰宝，她能造福全人类。推进中药现代化是保护、传承和发展中医药的关键，而将传统中医药与现代合成生物学技术相结合是实现中药现代化的重要途径：一方面，利用合成生物学技术，越来越多的中药活性成分，包括萜类、黄酮类、生物碱类等化合物，得以实现了基于异源生物合成的规模化制备，生物合成成为获取中药活性成分的新模式，这不仅可极大缓解中药材种植和加工的压力，而且能保障重要中药活性成分的高品质、低成本和稳定供应，减少传统中药应用中的质量和安全隐患；另一方面，利用合成生物学技术制备中药活性成分并对其开展药理学研究，将为中药药效研究及其阐释打下坚实的基础。未来，随着合成生物学技术的进步，相关使能工具的进一步开发与完善，以及生物大数据库、人工智能、高通量自动化平台等先进技术体系的融入，中药现代化进程必会大大加快。
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